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详细介绍Detailed Introduction

酵母单杂

酵母单杂交技术原理及应用:
酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上发展起来的技术,酵母单杂交主要用于研究蛋白质和DNA的相互作用,其原理如下:真核生物基因的转录起始需转录因子参与,转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成,即DNA结合结构域(DNA—binding domain,BD)和转录激活结构域(activation domain,AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子,GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS),而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用,提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中,DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此,我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因,只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用,同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶,启动下游报告基因的转录。
迄今为止,应用酵母单杂交体系已经识别并验证了许多与目的DNA序列结合的蛋白质,同时单杂交技术还被应用于识别金属反应结合因子。正向与反向单杂交体系的结合,还可用于筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的单个核苷酸。
目前,在研究DNA—蛋白质相互作用中,酵母单杂交体系主要有以下3种用途:①确定已知DNA—蛋白质之间是否存在相互作用;②分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因;③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域,以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。
 
酵母单杂交点对点验证实验流程:
(1) pBait-AbAi质粒及Bait酵母菌株构建。
(2) 测试Bait菌株的AbAr表达水平,并确定最低AbA生长抑制浓度。
(3) pGADT7-prey质粒转化Bait菌株,并用高于最低AbA生长抑制浓度的AbA平板筛选。
(4) 实验数据与报告整理
 
酵母单杂交文库筛选实验流程:
(1) pBait-AbAi质粒及Bait酵母菌株构建。
(2) 测试Bait菌株的AbAr表达水平,并确定最低AbA生长抑制浓度。
(3) pGADT7-prey质粒文库转化Bait菌株,并用高于最低AbA生长抑制浓度的AbA平板筛选。
(4) 文库筛选与阳性克隆测序分析
(5) 筛选结果回转验证
(6) 实验数据与报告整理
 
项目周期
酵母单杂交点对点验证约30天
酵母单杂交文库筛选约180天
 
酵母单杂交付结果
详细完整的实验报告,清晰的实验图片,筛选阳性克隆的测序结果、质粒等
 
客户下单项目信息填写:
1、客户按照提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式进行预提交;
2、提交项目所需要的具体信息,包括:(1)Bait质粒与prey质粒相关序列信息;(2)尽可能丰富的相关资料、文献。
 
实验信息:
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看地址。实验结题后,实验报告,检测结果可在线查看或打印,并永久保留。


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